ساخت و انتقال سازه خاموشی مشترک ژن های codm و t6odm با تکنیک rnai و vigsو بررسی تأثیر آن بر بیوسنتز آلکالوییدها در گیاه دارویی شقایق

گیاهان خانواده شقایق تنها منبع تجاری آلکالوییدهای دارویی مانند کدئین و مورفین و داروهای نیمه مصنوعی اکسی کدون و بیوپرینورفین است. با استفاده از دستورزی ژنتیکی آنزیم های کلیدی شرکت کننده در مسیر متابولیکی مورفین می توان میزان تولید مواد آلکالوییدی گیاه شقایق را تغییر داد. آنزیم های t6odm و codm آنزیم های مراحل انتهایی بیوسنتز مورفین هستند. آنزیم تبائین6 -o-دمتیلاز (t6odm) موجب دمتیلاسیون تبائین و اوری پاوین در موقعیت 6 و تبدیل آن ها به کدئینون و مورفینون می شود. کدئینo- دمتیلاز ((codm باعث دمتیله شدن تبائین در موقعیت 3 و تبدیل آن به اوری پاوین و همچنین دمتیله شدن کدئین و تبدیل آن به مورفین می شود. ژن های codm و t6odm حدود 83 درصد مشابهت دارند. با توجه به نقش ژن های t6odm و codm در مسیر بیوسنتز مورفین، در این پژوهش اثر خاموشی همزمان ژن codm و t6odm با فناوری rnai و vigs مورد بررسی قرار گرفت. با استفاده از cdna کامل ژن t6odm و آغازگرهای طراحی شده از ناحیه مشترک دو ژن، قطعه خاموشی ساخته و در ناقل حدواسط ptz57r/t همسانه سازی و سپس قطعه هدف خاموشی به ترتیب در جهت سنس و آنتی سنس و در دو مرحله در ناقل خاموشی pgsa1285 همسانه سازی شد. همچنین برای بررسی خاموشی هم زمان ژن های پیش گفته به صورت موقت و با روش vigs، قطعه هدف خاموشی در ناقل ویروسی trv2 همسانه سازی و سپس با استفاده از آگروباکتری حاوی سازه، به برگ-های گیاه شقایق تراریزش شد. از طریق واکنش pcr با آغازگرهای ژن پروتئین پوششی ویروس trv، گیاهان تراریخت شده انتخاب و آنالیز نیمه کمی بیان ژن انجام و برای سنجش دقیق میزان بیان ژن واکنش pcr در زمان واقعی انجام شد. نتایج نشان دهنده کاهش 86 درصدی بیان ژن codm و کاهش 87 درصدی بیان ژن t6odmدر مقایسه با نمونه های غیر تراریخت بود. میزان آلکالوییدها در گیاهان تراریخت و گیاهان غیر تراریخت با hplc اندازه گیری شد. در این پژوهش برای بهینه سازی انتقال ژن به گیاه شقایق و باززایی آن از ریزنمونه هیپوکوتیل و محیط پایه ms و آنتی بیوتیک پارامومایسین در شش سطح 5، 10، 15، 20، 25 و 30 میلی گرم در لیتر بعنوان عامل گزینشگر استفاده شد. برای مرحله ریشه-زایی آزمایش فاکتوریل با دو فاکتور محیط (شامل محیط ms و ms 2/1) و هورمون (شامل محیط دارای هورمون iba و محیط فاقد هورمون) طراحی شد. از نظر فنوتیپی دو نوع کالوس مشاهده شد. کالوس نوع 1 قهوه ای رنگ و از ابتدا بر روی ریزنمونه های هیپوکوتیل تشکیل شد و کالوس نوع 2 بصورت توده فشرده سفید رنگ بود. با افزایش غلظت آنتی بیوتیک میزان کالوس زایی و جنین زایی کاهش یافت. در بین تیمارهای ریشه زایی، تیمار محیط ms 2/1 با هورمون iba بیشترین تعداد گیاهچه ریشه دار را تولید کرد. dna گیاهچه های حاصل شده استخراج و با آغازگرهای ژن nptii واکنش pcr انجام و حضور ژن nptii و تراریختی گیاهان تأیید شد.